Isolasi
Mikroba
A. Pengertian
Di
alam populasi mikroba tidak terpisah sendiri menurut jenisnya, tetapi terdiri
dari campuran berbagai macam sel. Di dalam laboratorium pupulasi bakteri ini
dapat diisolasi menjadi kultur murni yang terdiri dari satu jenis yang dapat
dipelajari morfologi, sifat dan kemampuan biokimiawinya.
B. Teknik Pengambilan Sampel
Sebelum
melakukan isolasi terlebih dahulu dilakukan proses pengambilan sampel. Berikut
adalah prosedur pengambilan sampel sebagai berikut :
1. Sampel Tanah
Jika
mikroorganisme yang diinginkan kemungkinan berada didalam tanah, maka cara
pengambilannya disesuaikan dengan tujuan dan kebutuhan. Misalnya jika yang
diinginkan mikroorganisme rhizosfer maka sampel yang diambil dari sekitar
perakaran dekat permukaan hingga ujung perakaran.
2. Sampel Udara
Jika
mikroba yang diinginkan adalah berada di udara sekitar, misalnya di kamar
mandi, ruangan dan lain sebagainnya, maka caranya hanya dengan membuka tutup
cawan petri yang berisi media steril kurang lebih selama 5 menit.
3. Sampel Air
Pengambilan
sampel air bergantung pada keadaan air itu sendiri. Jika berasal dari air
sungai yang mengalir maka botol dicelupkan miring dengan bibir botol melawan
arus air. Bila pengambilan sampel dilakukan pada air yang tenang botol dapat
dicelupkan dengan menggunakan tali. Sedangkan jika ingin mengambil sampel dari
air keran maka sebelumnya keran dialirkan terlebih dahulu beberapa saat dan
mulut keran dibakar.
C. Isolasi Dengan Cara Pengenceran (Dilution)
1. Teknik Preparasi Suspensi
Sampel
yang telah diambil kemudian disuspensikan dalam akuades steril. Tujuan dari
teknik ini pada prinsipnya adalah melarutkan atau melepaskan mikroba dari
substratnya ke dalam air sehingga lebih mudah penanganannya. Macam-macam
preparsi bergantung kepada bentuk sampel :
a. Swab (Ulas)
Dilakukan
menggunakan cotton bud steril pada sampel yang memiliki permukaan luas dan pada
umumnya sulit dipindahkan atau sesuatu pada benda tersebut. Contohnya adalah
meja, batu, batang kayu dll. Caranya dengan mengusapkan cotton bud memutar
sehingga seluruh permukaan kapas dari cotton bud kontak dengan permukaan
sampel. Swab akan lebih baik jika cotton bud dicelupkan terlebih dahulu ke
dalam larutan atraktan semisal pepton water.
b. Rinse (Bilas)
Ditujukan
untuk melarutkan sel-sel mikroba yang menempel pada permukaan substrat yang
luas tapi relatif berukuran kecil, misalnya daun bunga dll. Rinse merupakan
prosedur kerja dengan mencelupkan sampel ke dalam akuades dengan perbandingan 1
: 9 (w/v). Contohnya sampel daun diambil dan ditimbang 5 gram kemudian dibilas
dengan akuades 45 ml yang terdapat dalam beaker glass.
c. Maseration (Pengancuran)
Sampel yang berbentuk padat dapat
ditumbuk dengan mortar dan pestle sehingga mikroba yang ada dipermukaan atau di
dalam dapat terlepas kemudian dilarutkan ke dalam air. Contoh sampelnya antar
alain bakso, biji, buah dll. Perbandingan antar berat sampel dengan pengenceran
pertama adalah 1 : 9 (w/v). Untuk sampel dari tanh tak perlu dimaserasi.
2.
Teknik
Pengenceran Bertingkat
Tujuan
dari pengenceran bertingkat yaitu memperkecil atau mengurangi jumlah mikroba
yang tersuspensi dalam cairan. Penentuan besarnya atau banyaknya tingkat
pengenceran tergantung kepada perkiraan jumlah mikroba dalam sampel. Digunakan
perbandingan 1 : 9 untuk sampel dan pengenceran pertama dan selanjutnya,
sehingga pengenceran berikutnya mengandung 1/10 sel mikroorganisma dari
pengenceran sebelumnya.
Cara Kerja :
1. Sampel yang
mengandung bakteri dimasukan ke dalam tabung pengenceran pertama (1/10 atau
10-1) secara aseptis (dari preparasi suspensi). Perbandingan berat sampel
dengan volume tabung pertama adalah 1 : 9 dan ingat akuades yang digunakan jika
memakai teknik rinse dan swab sudah termasuk pengencer 10-1. Setelah sampel
masuk lalu dilarutkan dengan mengocoknya (pengocokan yang benar dapat dilihat
pada gambar disamping)
2. Diambil 1 ml
dari tabung 10-1 dengan pipet ukur kemudian dipindahkan ke tabung 10-2 secara
aseptis kemudian dikocok dengan membenturkan tabung ke telapak tangan sampai
homogen. Pemindahan dilanjutkan hingga tabung pengenceran terakhir dengan cara
yang sama, hal yang perlu diingat bahwa pipet ukur yang digunakan harus selalu
diganti, artinya setiap tingkat pengenceran digunakan pipet ukur steril yang
berbeda/baru. Prinsipnya bahwa pipet tidak perlu diganti jika memindahkan
cairan dari sumber yang sama.
3. Teknik Penanaman
a. Teknik Penanaman Dari
Suspensi
Teknik
penanaman ini merupakan lajutan dari pengenceran bertingkat. Pengambilan
suspensi dapat diambil dari pengenceran mana saja tapi biasanya untuk tujuan
isolasi (mendapatkan koloni tunggal) diambil beberapa tabung pengenceran
terakhir.
1) Spread Plate (Agar Tabur Ulas)
Spread plate
adalah teknik menanam dengan menyebarkan suspensi bakteri di permukaan agar
diperoleh kultur murni. Adapun prosedur kerja yang dapat dilakukan adalah
sebagai berikut :
a) Ambil
suspensi cairan senamyak 0,1 ml dengan pipet ukur kemudian teteskan diatas
permukaan agar yang telah memadat.
b) Batang L
atau batang drugal diambil kemudian disemprot alkohol dan dibakar diatas bunsen
beberapa saat, kemudian didinginkan dan ditunggu beberapa detik.
c) Kemudian
disebarkan dengan menggosokannya pada permukaan agar supaya tetesan suspensi
merata, penyebaran akan lebih efektif bila cawan ikut diputar.
d) Hal yang
perlu diingat bahwa batang L yang terlalu panas dapat menyebabkan sel-sel
mikroorganisme dapat mati karena panas.
2) Pour Plate (Agar Tuang)
Teknik ini
memerlukan agar yang belum padat (>45°C) untuk dituang bersama suspensi
bakteri ke dalam cawan petri lalu kemudian dihomogenkan dan dibiarkan memadat.
Hal ini akan menyebarkan sel-sel bakteri tidak hanya pada permukaan agar saja
melainkan sel terendam agar (di dalam agar) sehingga terdapat sel yang tumbuh
dipermukaan agar yang kaya O2 dan ada yang tumbuh di dalam agar yang tidak
banyak begitu banyak mengandung oksigen. Adapun prosedur kerja yang dilakukan
adalah sebagai berikut :
a) Siapkan
cawan steril, tabung pengenceran yang akan ditanam dan media padat yang masih
cair (>45°C)
b) Teteskan 1
ml secara aseptis.suspensi sel kedalam cawan kosong
c) Tuangkan
media yang masih cair ke cawan kemudian putar cawan untuk menghomogenkan
suspensi bakteri dan media, kemudian diinkubasi.
Alasan
diteteskannya bakteri sebanyak 0,1 ml untuk spread plate dan 1 ml untuk pour
plate karena spread plate ditujukan untuk menumbuhkan dipermukaanya saja,
sedangkan pour plate membutuhkan ruang yang lebih luas untuk penyebarannya
sehingga diberikan lebih banyak dari pada spread plate.
b.
Teknik
Penanaman dengan Goresan (Streak)
Bertujuan
untuk mengisolasi mikroorganisme dari campurannya atau meremajakan kultur ke
dalam medium baru.
1) Goresan Sinambung
Cara kerja :
a) Sentuhkan
inokulum loop pada koloni dan gores secara kontinyu sampai setengah permukaan
agar.
b) Jangan
pijarkan loop, lalu putar cawan 180oC lanjutkan goresan sampai habis.
c) Goresan
sinambung umumnya digunakan bukan untuk mendapatkan koloni tunggal, melainkan
untuk peremajaan ke cawan atau medium baru.
2) Goresan T
Cara kerja :
a) Bagi cawan
menjadi 3 bagian menggunakan spidol marker
b) Inokulasi
daerah 1 dengan streak zig-zag
c) Panaskan
jarum inokulan dan tunggu dingin, kemudian lanjutkan streak zig-zag pada daerah
2 (streak pada gambar). Cawan diputar untuk memperoleh goresan yang sempurna
d) Lakukan hal
yang sama pada daerah 3
3) Goresan Kuadran (Streak quadrant)
Cara kerja :
Hampir sama
dengan goresan T, namun berpola goresan yang berbeda yaitu dibagi empat. Daerah
1 merupakan goresan awal sehingga masih mengandung banyak sel
mikroorganisma.Goresan selanjutnya dipotongkan atau disilangkan dari goresan pertama
sehingga jumlah semakin sedikit dan akhirnya terpisah-pisah menjadi koloni
tunggal.
Cara Kerja Isolasi Bakteri dari Sampel Tanah :
1. Tanah
seberat 1 gram dimasukan ke dalam tabung pengenceran 10-1 secara aseptis dan
selanjutnya dilakukan pengenceran bertingkat sampai 10-8
2. Tiga
pengenceran terakhir diambil 0,1 ml untuk ditanam secara spread plate pada
medium NA, setelah selesai, diinkubasi pada 37°C selama 1x24 jam
3. Koloni akan
tumbuh pada ketiga cawan tersebut kemudian dipilih koloni yang relatif terpisah
dari koloni lain dan koloni yang mudah dikenali
4. Koloni yang
terpilih kemudian ditumbuhkan atau dimurnikan ke NA baru dengan teknik streak
kuadran
5. Inkubasi 1x24
jam.
Cara Kerja Isolasi Jamur dari Tanah :
1. Tanah dalam
cawan petri dipanaskan dengan oven pada suhu 80°C selama 30 menit dengan cawan
petri untuk membunuh sel vegetatiftetap bertahan
2. Tanah yang
telah dioven diambil 1 gram kemudian dimasukan ke dalam tabung pengenceran
bertingkat
3. Tiga
pengenceran terakhir diambil untuk ditanama secara spread plate ke media PDA
yang ditambah streptomycin atau penicillin. Kemudian diinkubnasi pada suhu
ruang 5-7 hari
4. Koloni jamur
yang tumbuh dimurnikan dan ditanam pada medium PDA baru,
5. Inkubasi
pada suhu ruang 5-7 hari.
Tidak ada komentar:
Posting Komentar